實時熒光定量PCR

定量PCR已經從基于凝膠的低通量分析發展到高通量的熒光分析技術，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術于1996年推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。

實時熒光定量PCR 技術的主要應用：

1. DNA 或RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2. 基因表達差異分析：例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證。

3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等。

Realtime PCR 常用的兩種方法

SYBR Green（熒光染料摻入法）

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。

此方法特點：

1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上

2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。

3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。

4、高通量大規模的定量PCR檢測.

5、專一性要求不高的定量PCR檢測。

Taqman probe （探針法）

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。

此方法特點：

1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩定重復性好，特異性更高。

2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。

3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。

4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優化引物設計條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。

6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。

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